Javascript ist derzeit in Ihrem Browser deaktiviert.Mehrere Funktionen dieser Website funktionieren nicht, wenn Javascript deaktiviert ist.freier Zugang zu wissenschaftlicher und medizinischer ForschungPeer-reviewte wissenschaftliche und medizinische Open-Access-Zeitschriften.Dove Medical Press ist Mitglied des OAI.Massennachdrucke für die pharmazeutische Industrie.Wir bieten unseren Autoren echte Vorteile, einschließlich einer beschleunigten Bearbeitung von Papieren.Registrieren Sie Ihre spezifischen Daten und spezifischen Arzneimittel von Interesse und wir gleichen die von Ihnen bereitgestellten Informationen mit Artikeln aus unserer umfangreichen Datenbank ab und senden Ihnen umgehend PDF-Kopien per E-Mail zu.Zurück zu Zeitschriften » International Journal of Nanomedicine » Volume 17Autoren Guo Y, Li P, Wang Z, Zhang P, Wu XVeröffentlicht am 14. Oktober 2022 Band 2022:17 Seiten 4829—4842DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S377036Begutachtung durch einmaliges anonymes Peer-ReviewHerausgeber, der die Veröffentlichung genehmigt hat: Professor Lei YangYueming Guo,1 Pengpeng Li,2,3 Zongliang Wang,4 Peibiao Zhang,4 Xiaodong Wu2 1Department of Orthopaedics, Foshan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Foshan, 528000, Volksrepublik China;2Xuzhou Central Hospital, Xuzhou, 221009, Volksrepublik China;3Graduate School of Bengbu Medical College, Bengbu, 233030, Volksrepublik China;4Key Laboratory of Polymer Ecomaterials, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Changchun, 130022, Volksrepublik China Korrespondenz: Xiaodong Wu;Peibiao Zhang, E-Mail [email protected];[email protected] Einführung: Als beliebtes Nahrungsergänzungsmittel mit Schwefelverbindungen wird Methylsulfonylmethan (MSM) weithin als alternative orale Medizin verwendet, um Gelenkschmerzen zu lindern, Entzündungen zu reduzieren und die Kollagenproteinsynthese zu fördern.Es wird jedoch selten bei der Entwicklung bioaktiver Gerüste in der Knochengewebezüchtung verwendet.Methoden: Dreidimensionale (3D) poröse Gerüste aus Hydroxyapatit/Poly(lactid-co-glykolid) (HA/PLGA) mit unterschiedlichen Dotierungsniveaus von MSM wurden unter Verwendung der Phasentrennungsmethode hergestellt.MSM-Beladungseffizienz, In-vitro-Wirkstofffreisetzung sowie die biologische Aktivität von MSM-beladenen Gerüsten wurden durch Inkubation von Maus-Präosteoblasten (MC3T3-E1) in den einheitlichen und miteinander verbundenen porösen Gerüsten untersucht.Ergebnisse: Es wurde eine anhaltende Freisetzung von MSM aus den Gerüsten beobachtet, und die gesamte MSM-Freisetzung aus 1 % und 10 % MSM/HA/PLGA-Gerüsten innerhalb von 16 Tagen betrug bis zu 64,9 % bzw. 68,2 %.Die Zelllebensfähigkeit, -proliferation und die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) wurden durch den Einbau von 0,1 % MSM in die Gerüste signifikant gefördert.Die In-vivo-Fähigkeit zur Knochenbildung wurde für 1 % MSM/HA/PLGA-Gerüste signifikant verbessert, was durch die Reparatur von Kaninchenradiusdefekten angezeigt wird, die durch eine stimulierte Freisetzung von MSM durch Enzymsysteme in vivo beeinflusst werden könnten.Diskussion: Die Erkenntnisse aus dieser Studie zeigten, dass der Einbau von MSM bei der Verbesserung der Osteogeneseaktivität der porösen HA/PLGA-Gerüste wirksam wäre.Grafische Zusammenfassung: Schlüsselwörter: Biopolymer, Scaffold, Drug Delivery, Retard, OsteogeneseBone Tissue Engineering zielt darauf ab, hochporöse Gerüste mit angemessener Bioaktivität zu entwickeln, um die Bildung neuer Knochen zu erleichtern.1,2 Wachstumsfaktoren haben eine günstige Funktion zur Regeneration von Knochengewebe gezeigt, indem sie die Zellproliferation, Differenzierung sowie die Bildung von mineralisiertem Gewebe regulieren.Ein großer Nachteil besteht jedoch darin, dass die meisten von ihnen teuer sind und Krebs auslösen können.3,4 Ein zweiter Nachteil der Wachstumsfaktoren besteht darin, dass sie aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit und ihrer instabilen Eigenschaften nur schwer in Polymergerüste eingebracht werden können.5 Auf der Im Gegensatz dazu sind niedermolekulare Wirkstoffe mit ausgeprägter Bioaktivität aufgrund ihrer Stabilität und einfachen Verarbeitbarkeit mit Polymeren wertvoll für biofunktionalisierte polymere Gewebezüchtungsgerüste.6–8Methylsulfonylmethan (MSM, (CH3)2SO2) ist eine Organoschwefelverbindung, die das Bindegewebe im menschlichen Körper erhalten kann, indem sie von ihrem Schwefelgehalt profitiert.9–11 Es wurde berichtet, dass die gleichzeitige Inkubation von MSM und menschlichen Chondrozyten bei mittelschwerer Osteoarthritis inaktiv werden könnte die Kodierung von Genen zur Herstellung entzündungsfördernder Zytokine.12 Es zeigte sich, dass MSM in der Lage war, den Gelenkknorpel bei Patienten mit Arthrose zu schützen.Joung et al. berichteten, dass MSM die Signalübertragung von Wachstumshormonen (GH) und die osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) des Knochenmarks verbessern könnte.13 Sie fanden heraus, dass MSM die GH-Signalübertragung über den Weg von Januskinase/Signalwandlern und Aktivatoren der Transkription verstärken könnte ( Jak2/STAT5b) in Osteoblasten und fördern die Osteoblastendifferenzierung durch die Aktivierung von STAT5b in MSCs, wodurch die Genexpression des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) reguliert wird.In einer anderen Studie wurde die osteogene Differenzierung humaner parodontaler Stammzellen (hPDLSCs) von Ha et al. unter Verwendung von MSM untersucht.14 Die Autoren beobachteten, dass MSM nicht nur die Zellproliferation fördern, sondern auch die osteogene Differenzierung von hPDLSCs verbessern und die Differenzierung von hPDLSCs induzieren konnte hPDLSCs in Osteoblasten sowie Knochenbildung während der in vivo Knochenregeneration.Darüber hinaus erhöhte MSM auch die Matrixmineralisierung und Osteogenese durch Transglutaminase 2 (TG-2) in Stammzellen aus humanen exfolierten Milchzahnzellen (SHED).15 Zusätzlich zur direkten Anwendung von MSM zusammen mit organischem Silizium und Glucosaminsulfat als therapeutische Komponenten bei Unterkieferknochendefekten eine positive Wirkung zeigte, begleitet von Knochenresorption, MSM wurde selten durch gerüstunterstützte Abgabe zur Knochengeweberegeneration angewendet.16 In einer Studie wurde MSM für die Oberflächenbeschichtung von porösem Hydroxyapatit (HA)-Gerüst verwendet.17 MSM könnte bis zu 7 Tage von den Gerüsten befreit werden.Die 2,5 % MSM-beschichteten Scaffolds zeigten ein osteoinduktives und osteokonduktives Potenzial für die Knochenreparatur.In unserer früheren Arbeit haben wir MSM-beladene Poly(lactid-co-glykolid) (PLGA)-Fasermatten mit einer unterschiedlichen Menge an MSM hergestellt.18 Die Proliferation und die Bildung der extrazellulären Matrix (ECM) von Chondrozyten wurden verbessert, und es wäre vorteilhaft zur Knorpelregeneration.Gerüste sind unerlässlich für die Manipulation der Zelldifferenzierung und die Regeneration neuer Gewebe.5,19 Hydroxyapatit, das entweder Elemente von Strontium (Sr) und Silikat (SiO44−) enthält oder nicht, wurde in biologisch abbaubare Polymermaterialien zur Herstellung von Verbundgerüsten eingebaut, um den Knochenumbau zu verbessern Prozess.20–23 Darüber hinaus wurden auch einige neue Biomaterialien, insbesondere Nano-Antioxidantien, entwickelt, um sie in Gerüste für die Geweberegeneration einzubauen.Beispielsweise stellten Marino et al. elektrogesponnene Gelatine/Nanoceria-Nanokompositfasern her, und die selbstregenerierenden Nanoceria-inkorporierten Materialien verhielten sich als starkes Antioxidans zur Hemmung der Zellalterung und zur Förderung des Neuritensprossens bei der neuronalen Regeneration.24 Nanoceria wurde auch mit Polycaprolacton dekoriert und Gelatine (PCLG) gemischte Nanofaser, und es war interessant festzustellen, dass das nanostrukturierte Gerüst die Agonisten-induzierte Herzhypertrophie unterdrücken konnte, was auf ihr Potenzial als antioxidatives und antihypertrophisches Herzpflaster hindeutet.25 Asghar et al. entwickelten nanoporöses Zink-dotiertes Hydroxyapatit ( Zn-HA)-Gerüst und das radikalfangende Verhalten des Nanokomposit-Gerüsts implizierten ein großes Potenzial als gutes Antioxidans für die Anwendung bei der Knochenreparatur.26 Außerdem poröse Gerüste mit gewünschten Eigenschaften, wie z. B. geeigneten mechanischen Eigenschaften, guter innerer Porenarchitektur und angemessener Bioaktivität , sind für die Geweberegeneration sehr gefragt.27,28 Dahere, zahlreiche Gerüste wurden mit synthetischen oder natürlichen Polymeren unter Verwendung vieler Techniken entwickelt, darunter Phasentrennung,29 Auslaugen von Lösungsmittelgusspartikeln,30 Fasernetze,31 Gasschäumen,32,33 Rapid Prototyping34 und eine Reihe von dreidimensionalen ( 3D) oder vierdimensionale (4D) Druckansätze.35,36 Unter diesen Technologien besteht einer der attraktiven Vorteile der Phasentrennung darin, dass eine stark vernetzte poröse Struktur kontrollierbar und skalierbar gebildet werden kann, indem einfach die Herstellungsparameter wie Polymer reguliert werden Konzentration, Temperatur usw. und bioaktive Verbindungen können direkt eingebaut werden, ohne die intrinsische biologische Funktion zu beeinträchtigen.37 In unserer vorherigen Studie wurden poröse Nanokomposit-Gerüste mit wabenartiger Monolithstruktur unter Verwendung der Einphasen-Lösungs-Gefriertrocknungsmethode hergestellt.38Diese Arbeit zielt darauf ab, ein effizientes System zur Arzneimittelabgabe und verzögerten Freisetzung für die Knochenregeneration durch poröse 3D-HA/PLGA-Gerüste zu entwickeln, das die Bioaktivität während des Niedrigtemperatur-unterstützten Herstellungsprozesses bewahrt.Als eines der bioaktiven Moleküle wurde MSM mit unterschiedlicher Dotierung in die Scaffolds eingebaut.Die Interaktion zwischen Maus-Prä-Osteoblasten (MC3T3-E1) und den MSM-beladenen Scaffolds sowie Osteogenese-Fähigkeiten und In-vivo-Knochenbildung wurden systematisch untersucht.Ein modifiziertes Gefrier- und Vakuumtrocknungsverfahren wurde verwendet, um die porösen Gerüste herzustellen, wie in unserer vorherigen Studie beschrieben.38 d,l-Lactid (LA) und Glycolid (GA)-Monomer wurden von Purac (Niederlande) bezogen.Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA, LA:GA= 80:20, Mw = 80.000 g·mol−1) wurde wie zuvor beschrieben synthetisiert.39 Kurz gesagt, mit Hilfe von magnetischem Rühren und Ultraschallbehandlung wurde HA (Emperor Nano Material Co., Ltd, Nanjing, China) wurde gleichmäßig in entwässertem 1,4-Dioxan (Sigma-Aldrich, USA) suspendiert und zu einer Lösung von PLGA/1,4-Dioxan (10 %, w/v) gegeben. .MSM (Jilin Herun Chemical Co., Ltd., China) wurde in Aceton (Sigma-Aldrich, USA) gelöst und dann zu einer HA/PLGA/1,4-Dioxan-Lösung gegeben, um die MSM/HA/PLGA-Lösung zu erhalten.Das Volumenverhältnis von Aceton und 1,4-Dioxan in allen Gruppen war konsistent und die Dotierungsniveaus von MSM in den erhaltenen Verbundstoffen waren 0,01 %, 0,1 %, 1 % bzw. 10 %.Der HA-Gehalt in allen Verbundstoffen betrug 10 %.Die Lösungen wurden leicht gerührt, um eine homogene Suspension zu erhalten.Dann wurden die erhaltenen Kompositlösungen in den Polypropylen (PP)-Röhrchen bei 4 ° C für 24 Stunden ohne jeglichen Schutz eingefroren und dann bei –4 ° C vakuumgetrocknet, um 1,4-Dioxan gründlich zu entfernen.HA/PLGA-Gerüste ohne Zugabe von MSM wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie die Kontrolle hergestellt.Die Proben wurden in einem Vakuumtrockenschrank aufbewahrt.Brüchige Oberflächen wurden durch schnelles Abbrechen der gefrorenen Proben unter Verwendung von flüssigem Stickstoff (N2) erhalten.Die Goldschicht wurde gleichmäßig auf die Bruchfläche gesprüht.ESEM (XL30 FEG, Philips) wurde zum Beobachten der Mikrostruktur der verschiedenen porösen Gerüste detektiert.Eine modifizierte Methode durch Flüssigkeitsverdrängung wurde verwendet, um die Porosität der hergestellten Gerüste zu charakterisieren, und drei Proben für jede Gruppe wurden getestet.40 Kurz gesagt, eine Gerüstprobe mit einem anfänglichen Wi-Gewicht wurde in 4 ml Ethanol gegeben, gefolgt von einer Vakuumbehandlung bis keine Blasen mehr auftauchten.Das mit dem Gerüst eingetauchte Ethanolvolumen wurde als V1 betrachtet.Das Ethanol enthaltende Gerüst wurde schnell entfernt und sein Gewicht wurde als Wf aufgezeichnet.V2 wurde als das Restvolumen von Ethanol festgelegt und entsprechend wäre (V1-V2) das Gerüstvolumen.Die Gerüstporosität konnte durch Berechnung des im Gerüst verbleibenden Ethanolvolumens (Wf-Wi)/ρEthanol (ρEthanol=0,789 g·mL−1) ermittelt werden.Somit konnte die Öffnungsporosität wie folgt bestimmt werden:Porosität = [(Wf-Wi)/ρethanol]/(V1-V2)Die Druckfestigkeit und die Dreipunkt-Biegefestigkeit der Gerüste wurden unter Verwendung einer Universalprüfmaschine (Instron 1121, UK) wie zuvor berichtet41 bewertet. Zylinderförmige Proben mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Länge von 10 mm wurden auf Druck geprüft Festigkeit bei einer Traversengeschwindigkeit von 2 mm·min−1.Ähnliche zylinderförmige Proben mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Länge von 30 mm wurden auf Dreipunkt-Biegefestigkeit mit einer Traversengeschwindigkeit von 5 mm·min –1 getestet.Die Druckfestigkeit und Biegefestigkeit wurden gemäß den Normen SS-EN ISO 178:2019 bzw. SS-EN ISO 604:2002 berechnet.Für jede Bedingung wurden drei Wiederholungen getestet.Auf den mit 2 % Dimethyldichlorsilan (DMDC) vorbehandelten Deckgläsern wurden HA/PLGA-Verbundfilme mit unterschiedlichem MSM-Gehalt hergestellt.42 Der statische Wasserkontaktwinkel (Krüss DSA 10, Deutschland) wurde durch Messung des Wasserkontaktwinkels an drei verschiedenen erfasst Positionen der Verbundfolien gemäß ASTM D5946, um die Durchschnittswerte als Endergebnisse zu erhalten.43 Ein Wassertropfen von 6 μl wurde getropft, was die Anforderungen der ASTM-Standards im Bereich von 5 bis 8 μl erfüllt.Zwanzig mg MSM-beladene Kompositgerüste wurden genau gewogen und in 10 ml Salpetersäure (HNO3, Sigma-Aldrich, USA) gelöst.44 Das konstante Volumen wurde mit entionisiertem Wasser wie vom Protokoll gefordert auf 25 ml eingestellt.Die Quantifizierung von Schwefel (WS) wurde durch das Atomemissionsspektroskop mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES, Leeman Prodigy High Dispersion ICP, USA) nachgewiesen.Die folgende Gleichung könnte verwendet werden, um die tatsächliche MSM-Menge (WMSM) in jeder Probe zu berechnen:WMSM= WS×MMSM/MS,MMSM: Molmasse von MSM, 94 g·mol−1.MS: Molmasse von Schwefel, 32 g·mol−1.Drei Proben für jede Gruppe wurden getestet.Für die In-vitro-MSM-Freisetzung wurden 200 mg MSM-beladene Verbundgerüste in 10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH = 7,2) bei 37 °C unter ständigem Schütteln (100 U/min) eingetaucht.44 Die freigesetzte Flüssigkeit wurde zu unterschiedlichen Zeiten entnommen und mit frischem PBS aufgefrischt.Die Quantifizierung des freigesetzten Schwefels (WS) wurde durch ICP-OES nachgewiesen.Dann wurde das freigesetzte MSM (WMSM) gemäß der obigen Gleichung berechnet.Vier Proben für jede Gruppe wurden getestet.MC3T3-E1-Zellen (Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences) wurden unter Verwendung von Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Gibco, USA), kultiviert ), 100 mg·L−1 Penicillin (Sigma-Aldrich, USA) und 63 mg·L−1 Streptomycin (Sigma-Aldrich, USA) bei 37 °C und 5 % CO2 befeuchteter Atmosphäre.Das Medium wurde alle 2 Tage aufgefrischt.Die Zellen wurden mit einer Lösung von 0,25 % Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich, USA) verdaut, gefolgt von Zentrifugation und Resuspension in DMEM.Die Scaffolds mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 5 mm wurden in 24-Well-Platten gegeben und 60 min mit ultravioletten Strahlen (UV) sterilisiert und 15 min in Ethanol (70 %) vorbehandelt.Dann wurden die Proben dreimal mit PBS gespült und für weitere 10 min in DMEM eingetaucht.Zellen mit einer Dichte von 10 × 10 4 Zellen in einem 100-μl-Medium wurden auf jedes Gerüst ausgesät und für die anfängliche Zellanhaftung 4 Stunden lang kultiviert.Danach wurde 1 ml frisches DMEM vorsichtig auf jede Probe getropft und unter denselben Kultivierungsbedingungen inkubiert.Das Eindringen von Zellen in die Gerüste wurde durch Fluoreszenzmikroskopie (TE2000-U, NIKON, Japan) charakterisiert.Glutaraldehyd (2,5 %) wurde verwendet, um die Zellen 15 Minuten lang zu fixieren, und der Zellkern wurde mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, China) gefärbt, um das Zellverhalten zu untersuchen innerhalb der Gerüste.Die MC3T3-E1-Osteoblastenproliferation innerhalb der zusammengesetzten Gerüste wurde unter Verwendung des 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT, Sigma-Aldrich, USA)-Assays bestimmt. 41 Kurz gesagt, drei Wiederholungen der porösen Gerüste wurden mit MC3T3-E1-Zellen in einer Dichte von 4 × 104 Zellen in einem 100-µl-Medium ausgesät, gefolgt von der Zugabe von 1 ml DMEM 4 Stunden später in 24-Well-Gewebekulturplatten (Costar) .Die Zellen wurden für 3, 7 und 14 Tage bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.Das Medium wurde alle 2 Tage aufgefrischt.MTT-Lösung (100 &mgr;l, 5 mg/ml in PBS) wurde zu jeder Probe gegeben und die Inkubation für weitere 4 Stunden fortgesetzt.Das Medium wurde durch angesäuertes Isopropanol (750 &mgr;l, 2 ml 0,04 N HCl in 100 ml Isopropanol) zum Solubilisieren des umgewandelten Farbstoffs ersetzt.Dann wurden 200 &mgr;l der Lösung auf eine Platte mit 96 Vertiefungen übertragen, um die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 540 nm unter Verwendung eines Vollwellenlängen-Mikroplattenlesegeräts (Infinite M200, TECAN) zu messen.Der Durchschnittswert von drei Wiederholungen für jede Probe wurde erhalten.Das p-Nitrophenolphosphat-Assay-Kit (pNPP, Sigma-Aldrich, USA) wurde verwendet, um die Aktivitäten der alkalischen Phosphatase (ALP) von MC3T3-E1-Zellen zu bestimmen, die 7 Tage lang in den verschiedenen Gerüsten inkubiert wurden.45 MC3T3-E1-Zellen wurden dreimal gespült und mit Lysepuffer lysiert, gefolgt von Einfrieren und Auftauen.Dann wurden 200 μL pNPP-Lösung im Dunkeln in jede Vertiefung gegeben und gemäß Herstellerprotokoll 30 min bei 37 ° C inkubiert.Die optische Dichte (OD) bei 405 nm wurde durch einen Full Wavelength Microplate Reader (Infinite M200, TECAN) gemessen.Der Gesamtproteingehalt wurde mit einem Bicinchoninsäure (BCA, Sigma-Aldrich, USA)-Protein-Assay-Kit zur Normalisierung des ALP-Aktivitätswerts nachgewiesen.Drei Proben für jede Gruppe wurden getestet.Die Mittelwerte wurden als ALP-Aktivitäten erhalten.Ein Kaninchenradius mit einem kritischen Größendefekt wurde erstellt, um die Knochenregenerationsfähigkeit der MSM-inkorporierten Gerüste zu bewerten.46 Sechsunddreißig weiße Neuseeland-Kaninchen (männlich, 2 Monate alt, 2,5–3,0 kg) wurden vom Institute of Experimental bereitgestellt Tier der Universität Jilin.Die Tierversuche wurden vom Komitee für Tierpflege und -nutzung der Universität Jilin genehmigt.Die Kaninchen wurden im Institut für Versuchstiere der Universität Jilin aufgezogen, basierend auf den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren.Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen eingeteilt (n=6 pro Gruppe) und durch intramuskuläre Injektion von Xylazinhydrochlorid (0,2 ml·kg−1) anästhesiert.47 Die porösen Gerüste wurden in die Defekte des Kaninchens mit einem reinen Defekt eingebracht, ohne dass Gerüste als solche transplantiert wurden leere Kontrolle.Die Wunden wurden sorgfältig Schicht für Schicht vernäht.Nach der chirurgischen Operation wurden die Kaninchen 7 Tage lang frei in den Käfigen mit einer täglichen intramuskulären Injektion von Penicillin (jeweils 400.000 Einheiten) aufgezogen.Alle Wunden heilten allmählich ohne postoperative Komplikationen.Alle Tiere wurden nach 12 Wochen durch Ersticken mit Kohlendioxid eingeschläfert.Der Heilungsprozess des Knochendefekts wurde 4 und 12 Wochen nach der Operation anhand digitaler Röntgenaufnahmen (DR) mit dem CR 400 plus Filmless Radiology System (KODAK, USA) verfolgt.Die digitalen Röntgenaufnahmen wurden auf der Grundlage des Lane-Sandhu-Bewertungssystems weiter relativ quantifiziert, wie in der Ergänzungstabelle 1 gezeigt.48 Für jede Gruppe wurden mindestens sechs Proben getestet.Fünf unabhängige Untersucher wurden im Lane-Sandhu-System geschult und alle Punkte wurden individuell nach dem Grad der Knochenbildung, Verbindungen und Knochenmarkrekanalisation vergeben.Vier Punkte zeigen eine vollständige Knochenbildung an.Null Punkte bedeuten ein Versagen der Knochenbildung.Basierend auf der Integrität der Frakturlinie werden 0, 2 und 4 Punkte vergeben, um den Grad der Verbindung aufzuzeigen.Vier Punkte zeigen an, dass keine Frakturlinie beobachtet werden kann.Dagegen können 0 Punkte vergeben werden.Der Grad der Rekanalisation für die Rekanalisation des Knochenmarks kann durch die Vergabe von 0, 2 oder 4 Punkten identifiziert werden.Alle Daten wurden mit Origin 8.0 (OriginLab Corporation, USA) analysiert und der Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angezeigt.Zur Bewertung der Varianz wurde eine statistische Analyse durchgeführt (Einweg-ANOVA, Origin 8.0).Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.Die innere Struktur der porösen Gerüste von HA/PLGA und MSM/HA/PLGA wurde durch ESEM nachgewiesen, wie in Abbildung 1 gezeigt. Eine ähnliche hochporöse Mikrostruktur wurde in allen Gerüsten beobachtet.Die Poren in allen Gerüsten waren gleichmäßig verteilt mit miteinander verbundenen Porenstrukturen (Abbildung 1 aa bis ea).Die Beobachtung unter starker Vergrößerung zeigte, dass aufgrund des Vorhandenseins von Nano-HA-Partikeln raue Oberflächen in allen Gerüsten festgestellt wurden (Abbildung 1 ab bis eb).Abbildung 1 ESEM-Bilder von porösen Gerüsten aus HA/PLGA (a), 0,01 % MSM/HA/PLGA (b), 0,1 % MSM/HA/PLGA (c), 1 % MSM/HA/PLGA (d) und 10 % MSM/HA/PLGA (e).Die Bilder werden bei niedriger (–1) und hoher (–2) Vergrößerung gezeigt.Die Stablängen betragen 500 μm bzw. 50 μm.Abbildung 1 ESEM-Bilder von porösen Gerüsten aus HA/PLGA (a), 0,01 % MSM/HA/PLGA (b), 0,1 % MSM/HA/PLGA (c), 1 % MSM/HA/PLGA (d) und 10 % MSM/HA/PLGA (e).Die Bilder werden bei niedriger (–1) und hoher (–2) Vergrößerung gezeigt.Die Stablängen betragen 500 μm bzw. 50 μm.Die Porosität der verschiedenen Gerüste ist in Tabelle 1 angegeben. Obwohl die Zugabe von MSM die Gerüstporosität leicht erhöhte, wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet (p > 0,05).Daher konnte geschlussfolgert werden, dass das Dotieren von MSM keine offensichtliche Wirkung auf die Porosität von Verbundgerüsten hatte.Tabelle 1 Porosität der verschiedenen GerüsteTabelle 1 Porosität der verschiedenen GerüsteWie in Tabelle 2 gezeigt, nahm der Wasserkontaktwinkel der Verbundfolien allmählich mit steigendem MSM-Gehalt ab.Der Wasserkontaktwinkel von 1 % MSM/HA/PLGA-Folie war niedriger als bei den Proben von HA/PLGA-, 0,01 %- und 0,1 % MSM/HA/PLGA-Folien (p < 0,05).Der Wasserkontaktwinkel von 10 % MSM/HA/PLGA-Folie war ebenfalls signifikant niedriger als der der Proben von HA/PLGA 0,01 % und 0,1 % MSM/HA/PLGA-Folien (p < 0,05).Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen 1 % und 10 % MSM/HA/PLGA-Filmen (p > 0,05).Tabelle 2 Wasserkontaktwinkel der verschiedenen Filme mit eingebautem MSMTabelle 2 Wasserkontaktwinkel der verschiedenen Filme mit eingebautem MSMDie Druck- und Biegefestigkeit von porösen HA/PLGA- und MSM/HA/PLGA-Gerüsten sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Druckfestigkeit nahm mit zunehmender MSM-Menge bis zu 1 % ohne signifikante Unterschiede leicht ab (p > 0,05).Das Gerüst aus 10 % MSM/HA/PLGA zeigte die minimale Druckfestigkeit (p < 0,05).In ähnlicher Weise wurde eine verringerte Biegefestigkeit beobachtet, wenn der Gehalt an MSM zunahm, und das Verbundgerüst aus 10 % MSM/HA/PLGA zeigte die niedrigste Biegefestigkeit (p < 0,05).Tabelle 3 Druck- und Biegefestigkeit der verschiedenen Gerüste mit eingebautem MSMTabelle 3 Druck- und Biegefestigkeit der verschiedenen Gerüste mit eingebautem MSMDie Beladungseffizienz von MSM in den Verbundgerüsten ist in der Ergänzungstabelle 2 dargestellt. Der tatsächliche MSM-Gehalt in den Verbundgerüsten stieg allmählich mit zunehmendem Futtergewichtsanteil.Der inkorporierte MSM-Gehalt war demnach aufgrund der Sublimation von MSM während des Herstellungsprozesses geringer als die theoretische Menge.Zwei Gruppen der MSM-inkorporierten Gerüste wurden auf Wirkstofffreisetzung untersucht, wie in Abbildung 2 gezeigt. Das freigesetzte MSM von 1 % und 10 % MSM/HA/PLGA-Gerüsten stieg während der ersten 48 Stunden auf etwa 60 % an.Die Gesamtmenge an MSM, die von 1 % und 10 % MSM/HA/PLGA-Gerüsten freigesetzt wurde, betrug 64,9 % bzw. 68,2 % nach 384 Stunden.Es zeigte, dass MSM nachhaltig aus den MSM/HA/PLGA-Gerüsten freigesetzt werden konnte.Die anhaltende Freisetzung von MSM aus den porösen Gerüsten kann seine therapeutische Wirkung auf die Regulierung des Zellstoffwechsels zur Knochenregeneration oder Arthrose in vivo verlängern.Abbildung 2 Kumulative Freisetzung von MSM aus 1 % und 10 % MSM/HA/PLGA-Gerüsten in PBS für 384 Stunden.Abbildung 2 Kumulative Freisetzung von MSM aus 1 % und 10 % MSM/HA/PLGA-Gerüsten in PBS für 384 Stunden.Die räumlich verteilten Zellen in den Gerüsten wurden nach 7-tägiger Kultivierung durch Färben des Zellkerns mit DAPI bewertet.In den Gerüsten wurden Zellkerne gefunden, insbesondere für die 0,01 %, 0,1 % und 1 % MSM/HA/PLGA-Gerüste (ergänzende Abbildung 1B–D).HA/PLGA- und 10 % MSM/HA/PLGA-Gerüste (ergänzende Abbildungen 1A und E) zeigten eine ähnliche Zellmenge und -verteilung, die viel geringer war als bei den anderen Gruppen.Abbildung 3 zeigt, dass die Zellproliferation in MSM-inkorporierten Gerüsten an den Tagen 3, 7 und 14 besser war als in den HA/PLGA-Gerüsten, insbesondere für die 0,1 % MSM/HA/PLGA-Gerüste.Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellproliferation durch den Einbau von MSM während der Zellkultur gefördert wurde.Abbildung 3 Die Proliferation von MC3T3-E1-Zellen, die in den verschiedenen Gerüsten für 3, 7 und 14 Tage kultiviert wurden.Mittelwert ± Standardabweichung, n=4.*Signifikanter Unterschied, p < 0,05.Abbildung 3 Die Proliferation von MC3T3-E1-Zellen, die in den verschiedenen Gerüsten für 3, 7 und 14 Tage kultiviert wurden.Mittelwert ± Standardabweichung, n=4.*Signifikanter Unterschied, p < 0,05.Die zelluläre ALP-Aktivität wurde mit den unterschiedlichen Dotierungsniveaus von MSM in den zusammengesetzten Gerüsten bewertet (Abbildung 4).An Tag 7 waren die ALP-Aktivitäten in allen MSM-beladenen Gerüsten mit einem signifikanten Unterschied (p < 0,05) erhöht.Darüber hinaus war die ALP-Aktivität von 0,1 % MSM/HA/PLGA-Gerüsten die höchste unter allen MSM-inkorporierten Gruppen (p < 0,05).Es deutete auf die Osteoinduktivität von MSM-inkorporierten Gerüsten hin.Abbildung 4 Alkalische Phosphatase-Aktivität von MC3T3-E1-Zellen, die 7 Tage lang in den verschiedenen Gerüsten kultiviert wurden.Mittelwert ± Standardabweichung, n=3.*Signifikanter Unterschied, p < 0,05.Abbildung 4 Alkalische Phosphatase-Aktivität von MC3T3-E1-Zellen, die 7 Tage lang in den verschiedenen Gerüsten kultiviert wurden.Mittelwert ± Standardabweichung, n=3.*Signifikanter Unterschied, p < 0,05.Schließlich wurde eine poröse Gerüstbeladung von MSM in Knochendefekte kritischer Größe zur Knochenregeneration transplantiert.Die Knochenbildung wurde mittels DR 4 und 12 Wochen nach der Transplantation untersucht (Abbildung 5).Vier Wochen nach der Operation wurde bei den Blindkontrollgruppen nur ein kleiner Knochenkallus am Rand des Knochendefekts beobachtet (Abbildung 5 aa).In den gerüsttransplantierten Defekten trat jedoch Knochenschwiele auf (Abbildung 5 ba, ca, da, ea und fa).Es wurde festgestellt, dass die Knochendefekte für 0,01 %, 0,1 % und 1 % MSM/HA/PLGA-Gerüste durch die Bildung von neuem Knochengewebe überbrückt wurden (Abbildung 5 ca, da und ea).Während eine offensichtliche Lücke zwischen der Knochenbildung in den Gruppen von HA/PLGA- und 10 % MSM/HA/PLGA-Gerüsten ebenfalls beobachtet wurde (Abbildung 5 ba und fa).Die Gruppe mit 1 % MSM/HA/PLGA (Abbildung 5 ea) zeigte die höchste Dichte des Röntgenbilds, und die Gruppe mit 0,01 % MSM/HA/PLGA (Abbildung 5 ca) zeigte die größte Fläche neu gebildeten Knochens.Abbildung 5 Repräsentative DR-Bilder von Kaninchen-Radiusdefekten, denen die verschiedenen Gerüste 4 Wochen (–1) und 12 Wochen (–2) nach der Operation implantiert wurden: Blindkontrolle (a), HA/PLGA (b) und HA/PLGA mit MSM : 0,01 % (c), 0,1 % (d), 1 % (e) und 10 % (f).Abbildung 5 Repräsentative DR-Bilder von Kaninchen-Radiusdefekten, denen die verschiedenen Gerüste 4 Wochen (–1) und 12 Wochen (–2) nach der Operation implantiert wurden: Blindkontrolle (a), HA/PLGA (b) und HA/PLGA mit MSM : 0,01 % (c), 0,1 % (d), 1 % (e) und 10 % (f).Wie durch DR bestätigt, war die Knochenneubildung für die Blindkontroll- und HA/PLGA-Gruppen 12 Wochen nach der Operation nicht bemerkenswert (Abbildung 5 ab und bb).Im Gegensatz dazu zeigte die Transplantation der mit MSM beladenen Gerüste nach 12 Wochen eine größere Menge an Knochenbildung als die HA/PLGA-Gerüste oder die Blindkontrolle.Die Implantation mit den MSM-beladenen Gerüsten zeigte überbrückte Defekte mit mehr neuer Knochenbildung (Abbildung 5 cb, db, eb und fb).Die Lane-Sandhu-Bewertungsergebnisse sind in Abbildung 6 dargestellt. Die Bewertung der 0,1 % MSM/HA/PLGA-Gruppe war die höchste unter allen Gruppen ohne signifikanten Unterschied 4 Wochen nach der Operation (p > 0,05).Die von 1 % MSM/HA/PLGA-Scaffolds erhaltenen Werte waren höher als die anderer Gruppen mit signifikantem Unterschied, mit Ausnahme der 10 % MSM/HA/PLGA-Gruppe 12 Wochen nach der Operation (p < 0,05).Es wurde jedoch kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Restgruppen gefunden (p > 0,05).Abbildung 6 Lane-Sandhu-Röntgenergebnisse von Kaninchenradiusdefekten der Blindkontrolle und implantiert mit den verschiedenen Gerüsten 4 und 12 Wochen nach der Operation.*Signifikanter Unterschied, p < 0,05.Abbildung 6 Lane-Sandhu-Röntgenergebnisse von Kaninchenradiusdefekten der Blindkontrolle und implantiert mit den verschiedenen Gerüsten 4 und 12 Wochen nach der Operation.*Signifikanter Unterschied, p < 0,05.Tissue Engineering zielt darauf ab, künstliche Gewebe und Organe unter Verwendung von biologisch abbaubaren Gerüsten und verschiedenen funktionellen Nanomaterialien zu schaffen.49,50 Zu diesem Zweck ist die Entwicklung einer 3D-Architektur mit idealer Porenarchitektur entscheidend für das Zellverhalten und die Bildung neuer Gewebe, die eine effiziente Abgabe von Medikamenten und biologischen Molekülen darstellen sowie Stammzellen.51,52 Daher spielen Porengröße, Porosität, die Rauheit der Porenoberflächen und die Bioaktivität von Gerüsten eine entscheidende Rolle bei der Regeneration von Geweben.In dieser Studie wurden hochporöse Gerüste unter Verwendung der Phasentrennungsmethode hergestellt, und gefrorenes Lösungsmittel war förderlich für die Bildung der Porenstrukturen, wie in unserem vorherigen Bericht beschrieben.38 Beobachtungen von ESEM zeigten, dass alle Gerüste mit oder ohne MSM-Einbau ähnliches aufwiesen Porenstrukturen mit einer Porengröße von 50–250 µm und die Poren der Gerüste waren gleichmäßig verteilt mit miteinander verbundenen Mikrostrukturen, was impliziert, dass die Einarbeitung von MSM die poröse Struktur der Gerüste nicht beeinflusste.Auch die Porosität der Scaffolds wurde durch den Einbau von MSM nicht beeinflusst.Die geringere Druck- und Biegefestigkeit der mit 10 % MSM dotierten Gerüste deutete darauf hin, dass eine höhere MSM-Menge weniger Polymermatrix bedeutete, was zu schlechteren mechanischen Eigenschaften führte.53 Die Ergebnisse zeigten, dass eine höhere Einarbeitung von MSM die mechanischen Eigenschaften der Verbundgerüste beeinflusste, insbesondere für eine 10%ige MSM-Menge in den zusammengesetzten Gerüsten.Dies stimmt sehr gut mit den berichteten Ergebnissen überein, dass die Expression von Osteogenesemarkern von hDPSCs durch die Zugabe von Simvastatin (SIM) und HA in die nanofaserigen Gerüste von Poly(ε-caprolacton) (PCL)/Polymilchsäure (PLLA) hochreguliert wurde. 54 Es deutete an, dass eine bessere Zellreaktion durch die Kombination niedermolekularer Medikamente (z. B. MSM) mit HA-Nanopartikeln in Polymermatrizen erreicht werden könnte.Frühere Studien zeigten, dass die Rauheit und Benetzbarkeit der Porenoberfläche in engem Zusammenhang mit der Zellinteraktion mit den Gerüsten stehen.55–57 Die Oberflächen der Porenwände aller erhaltenen Gerüste waren aufgrund der Anwesenheit von HA-Nanopartikeln rau.Die Rauheit der Porenoberfläche und die Osteokonduktivität wären vorteilhaft für die Lebensfähigkeit, Ausbreitung, Proliferation und Differenzierung von Zellen.58,59 Der signifikant verringerte Wasserkontaktwinkel von MSM-inkorporierten Gerüsten, insbesondere für die 1%- und 10%-Gruppen, deutete darauf hin, dass die Oberflächenbenetzbarkeit war wesentlich verbessert durch die effiziente Frachtbeladung mit bioaktiven Substanzen.Die Zellproliferation wurde durch die Zugabe von MSM in die Scaffolds signifikant gesteigert, zumal der Gehalt an MSM mehr als 0,01 % betrug.Während die Zellproliferation von 0,1 % MSM/HA/PLGA-Scaffolds weiter besser war als die Gruppen von 1 % und 10 % ohne signifikanten Unterschied.Die durch Zellkernfärbung bewertete Zellmenge zeigte, dass die Zellverteilung in den Gerüsten für die 0,01 %, 0,1 % und 1 % MSM/HA/PLGA-Gerüste günstiger war, was mit den MTT-Ergebnissen übereinstimmte und auf die angemessene Menge hinwies von MSM im porösen Gerüst wäre für die Zellproliferation von Vorteil.Dies stimmte mit früheren Studien überein, denen zufolge MSM-inkorporierte elektrogesponnene Fasern die Proliferation und extrazelluläre Bildung von Chondrozyten in vitro förderten,18 die Inkubation von 10 mg·mL−1 MSM für 24 Stunden nicht toxisch für murine Makrophagen war,60 und es gab keine nachteiligen Wirkungen oder Sterblichkeit beobachtet bei oraler Verabreichung von MSM mit 1,5 g·kg–1·Tag–1 für 90 Tage bei Ratten.61Unter den wichtigen osteogenen Markern ist die ALP-Aktivität während der frühen Zeitpunkte der Osteogenese kritisch.62 Die ALP-Aktivität von MC3T3-E1-Zellen, die am Tag 7 den Gerüsten ausgesetzt wurden, war in den MSM-beladenen Gerüsten im Vergleich zu den HA/PLGA-Gerüsten signifikant erhöht , indicating that MSM was able to induce an up-regulating of ALP which was relevant to the early performance of osteogenesis differentiation.63 Among the MSM-doped groups, the highest cellular ALP activity was observed in the 0.1% MSM/HA/PLGA scaffold .Plus eins.Plus eins.Alle Rechte vorbehalten.Registriert in England und Wales.